배경: 세포 내 신호전달에 중요한 단백질인 포스포리파제 C-β4(phospholipase C-β4, PLC-β4)의 물리화학적 성질을 연구하기 위해서는 다량의 정제된 단백질이 필요하나 기존의 망막 조직을 이용한 정제 방법은 그 방법이 매우 어려워 충분한 양의 단백질을 정제하는 것이 거의 불가능하다. 따라서 이를 쉽게 정제하기 위하여 배큘로바이러스(baculovirus)를 이용한 발현 및 정제 방법을 개발할 필요가 있다. 또한 배큘로바이러스를 이용한 정제 방법이 확립된 경우 이를 이용하여 키메라 단백질의 발현도 쉽게 할 수 있어 단백질의 성질연구에 매우 유용하다. 따라서 배큘로바이러스 발현 시스템을 이용 한 PLC-β4의 발현 방법을 개발하고, 이를 이용하여 PLC-β3/β4 및 PLC-β4/β3 키메라 단백질을 제조하였다. 방법: Polymerase chain reaction 방법으로 PLC-β4를 배큘로바이러스 발현 벡터에 클로닝한 후 Sf9 세포에 감염시켜 PLC-β4 단백질을 발현시켰다. 이를 TSK phenyl-5PW column과 TSK heparin-5PWcolumn을 이용한 순차적 high performnance liquid chromatography(HPLC)를 이용하여 정제하였다. 동일한 방법을 이용하여 PLC-β3/β4및 PLC-β4/β3 키메라 단백질을 발현하였다. 결과: 2차례의 HPLC 정제를 통하여 PLC-β4를 30배 이상으로 정제할 수 있었으며, 이렇게 정제한 단백질은 PLC의 활성도를 가지고있었다. 배큘로바이러스를 이용한 PLC-β3/β4 및 PLC-β4/β3 키메라단백질 발현은 항체를 이용한 면역블롯법으로 단백질이 발현됨은 확인하였으나 PLC-β3/β4 키메라 단백질은 PLC의 활성도를 가지고 있었으나 PLC-β4/β3 키메라 단백질은 PLC 활성도를 보이지 않았다. 결론: 배큘로바이러스를 이용한 단백질의 발현 방법은 PLC-β4 단백질을 효과적으로 발현할 수 있었으며, 이 방법을 이용하여 다량의 순수한 PLC-β4 단백질을 HPLC 방법을 통하여 정제할 수 있었고, 이는 향후 PLC-β4의 물리화학적 성질을 연구하는 데 유용하게 이용될 것이다. 키메라 단백질을 이용한 PLC-β3와 PLC-β4의 구조와 활성도의 관계 연구에서는 서로의 N 말단부 부위와 C 말단부 부위를 바꾸었을 때 활성도를 완전히 잃는 경우가 발생하는 것을 볼 때에 단백질의 기능에 있어 3차 구조의 미세한 차이가 기능에 큰 영향을 줄 수 있음을 확인하였다.

Background: Phospholipase C-β4 (PLC- β4) is known to be one of the most important signal transducing molecules; however, its biophysical and chemical characteristics are not well known due to the difficulty in purifying PLC- β4 from bovine retina. In the present study, we used the baculovirus expression system in order to express and purify large amounts of PLC- β4. With this system, we also tried to produce chimeric PLC- β3/β4 and PLC- β4/β3 protein in order to study the structure-activity relationship between N terminal and C terminal portion of PLC- βs. Methods: I cloned PLC- β4 to the baculovirus expression system by the polymerase chain reaction method and infected the PLC- β4 to Sf9 cells. I purified recombinant PLC- β4 proteins using sequential high performnance liquid chromatography (HPLC) by using the TSK phenyl-5PW column and the TSK heparin-5PW column. With this similar method, I was able to express chimeric PLC-β3/β4 and PLC- β4/β3 proteins. Results: With the two step HPLC, I was able to purify PLC- β4 by 30-fold; this purified PLC- β4 contained PLC activity. I also expressed chimeric PLC- β3/ β4 and PLC- β4/ β3 using the baculovirus system, and their expression was confirmed by the immunoblot method. However, chimeric PLC- β4/ β3 did not show PLC activity, while chimeric PLC- β3/ β4 retained its PLC-activity. Conclusion: Expression of chimeric PLC- β4 using the baculovirus system was an effi cient method to obtain a large amount of protein. Moreover, this expression and purification method would be useful in studying the physical and chemical characteristics of this protein. In my study using chimeric PLC- protein by swapping the N terminal and C terminal portions of PLC- β3 and β4, chimeric protein lost its activity completely in PLC- β4/β3 chimera. This result suggested a minute change in the tertiary structure of the protein, which may significantly affect its function. (Endocrinol Metab 27:282-288, 2012)