목적 : Multicolor FISH 기법을 최적화시키고, 최단시간에 진단이 가능하도록 개발 향상시킨 후 인간 배아에서 생검된 할구를 대상으로 염색체의 이수배수체를 배아의 착상 전 단계에서 유전진단하고자 하였다. 연구방법 : 1차년도 연구에서는 FISH 시술시 최적화의 최종 목표는 빠른 시간내에 정확한 결과를 얻는 것이므로 중기 염색체 및 간기 세포핵을 대상으로 FISH 시술의 제반 조건을 최적화하였다. 2차년도 연구에서는 1차년도에 적정화된 FISH 기술의 제반 조건을 진일보시켜 비정상 수정 및 발생 정지된 인간 배아의 할구에서 FISH 시술시 조건을 최적화하였다. 결과 : 1차년도 연구 결과: 중기 염색체 및 간기 세포핵을 대상으로 성염색체 특이 DNA probe를 이용하여 FISH를 시행한 결과 직접법에서 간접법에 비하여 2.5시간 더 빠르게 결과를 얻을 수 있었으며, 두 방법 모두에서 위음성 결과는 관찰할 수 없었다. 직접법 FISH 시술시 표적 DNA와 DNA probe를 동시에 denaturation 시키는 기법을 개발한 결과 기존 방법에 비하여 1시간 정도 더 빠르게 결과를 얻을 수 있었으며, FISH 결과에도 전혀 영향을 주지 않았다. 따라서 FISH 시술시 기존 방법과 비교하여 3.5시간의 소요시간을 줄일 수 있게 되어 배아의 착상 전 유전진단시 가장 적합한 FISH 시술 방법이 개발 확립되었다. 체외수정시술시 비정상적으로 수정된 배아를 대상으로 인간 배아에서의 할구 생검 기술을 우선적으로 습득하였으며, 본 연구실에서 개발된 FISH 시술 방법을 이용한 결과 생검된 할구 중 70%에서 성공적인 FISH 시술 결과를 얻을 수 있었다. 2차년도 연구 결과: 배아의 착상 전 유전진단 기술의 임상적 유용성을 확보하려면 생검된 할구 모두에서 유전학적 이상을 진단할 수 있어야 하며, 가능한한 많은 수의 염색체에 대한 이상 유무를 동시에 관찰할 수 있어야 하므로 FISH 시술 전 할구의 준비 조건 등을 개선하였으며, 다수의 염색체에 대한 정보를 동시에 얻을 수 있는 Multicolor FISH 기술을 개발하였다. 체외수정시술 환자 23명에서 얻은 37개의 비정상 수정 배아로부터 생검한 총 118개의 할구를 대상으로 6-color FISH 기술을 적용한 결과 114개(96.6%)의 할구에서 형광 signal을 이용하여 다양한 형태의 염색체 이상을 분석할 수 있었다. 결론 : 인간 배아의 착상 전 유전진단시 가장 적합한 FISH 시술 방법이 개발 확립되었으며, 인간 배아의 생검된 할구에서 Multicolor FISH 기술을 적용하여 90% 이상의 할구에서 형광 signal을 관찰할 수 있어 실제적 임상 적용을 위한 최적화된 Multicolor FISH 기술이 개발 확립되었다. 본 연구 결과 인간의 유전질환 중 가장 대표적인 세포유전학적 원인인 이수배수체 등의 염색체 이상을 배아의 착상 전 단계에서 유전진단할 수 있는 Multicolor FISH 기술이 성공적으로 개발되었다.

Objective : The genetic defects in human gametes and embryos can cause the adverse effects on overall reproductive events. Biopsy of embryos for preimplantation genetic diagnosis(PGD) offers a new possibility of having children free of the genetic disease. In this study, we attempted to attain the optimized methodology of Multicolor fluorescent in situ hybridization(FISH) technique, and then to apply the developed technique for the diagnosis of chromosomal abnormality such as aneuploidy in biopsied blastomeres of human embryos in a shorter time. Methods : In the first-year study, various experimental conditions for FISH applied to the chromosomes of metaphase and interphase nuclei were performed to get an accurate and rapid result of FISH, and the simultaneous denaturation technique of both target DNA and DNA probe was developed. In the second-year study, the experimental conditions for FISH established appropriately in the first year were advancingly improved and optimized utilizing the abnormally fertilized and developmentally arrested human embryos to establish the clinical efficacy of PGD in human embryos. Results : In the first-year study, the direct method of FISH with the sex chromosome-specific DNA probes could show the results 2.5 hours earlier than the indirect method, and there were no false negative results in either method. The next step was to develop the simultaneous denaturation technique of both target DNA and DNA probe, and the duration time to get the results could be shortened by an hour without affecting the results of FISH, compared with the conventional method. Accordingly, the most appropriate methodology of FISH was developed and established through reducing the required time for FISH by 3.5 hours, compared with the conventional method. Human blastomere biopsy technique was also acquired utilizing the abnormally fertilized embryos in IVF-ET program, and the application of newly developed FISH technique resulted in 70% of success rate in our laboratory. In the second-year study, the conditions for blastomere preparation prior to FISH were improved, and Multicolor FISH technique was developed for the simultaneous availability of information on many chromosomes. Multicolor FISH was applied to the blastomeres biopsied from the abnormally fertilized and developmentally arrested human embryos, and the fluorescent signals could be observed successfully in more than 90% of blastomeres. With the application of 6 color FISH to 118 blastomeres biopsied from 37 abnormally fertilized embryos in 23 infertile patients undergoing IVF-ET, various chromosomal abnormalities were analyzed in 114 blastomeres(96.6%). Conclusions : The most appropriately optimized Multicolor FISH technique was developed and established for the practical use of clinical application. The final goal of this project on the development of PGD using Multicolor FISH technique for the chromosomal abnormality in human embryos was successfully achieved by establishment of the prevention measures on the birth of infants with aneuploidy which is one of the most frequent chromosomal anomalies.