목적: 난자의 성숙 및 수정에서 초기 난할에 이르는 과정과 배란된 난자와 난관 내부환경사이의 복잡한 생화학적 기전을 이해하는데 중요한 fibronectin, tenascin 및 laminin의 생성을 난자-난구 복합체에서 알아보고자 면역형광염색후 공초점 레이져 주사현미경 검색을 시행하였다. 방법: 생쥐의 난소로 부터 얻은 난자-난구 복합체를 hCG가 첨가된 배양액에서 24시간, 48시간 배양한 후 각각의 복합체를 3.7% formaldehyde에 고정한 다음 3종류의 부착단백질에 대한 단클론성 일차항체의 혼합용액과 형광염료가 부착된 이차항체 혼합용액을 이용하여 3중 면역형광염색을 시행하였다. 염색된 슬라이드는 각각의 형광신호를 동시에 또는 분리하여 관찰이 가능한 공초점 레이져 주사현미경으로 관찰하였으며 동일한 조건의 난자-난구 복합체에서 투사전자현미경을 이용하여 세포내 미세구조물들의 변화를 관찰하였다. 결과: 면역형광염색 결과 적색의 형광신호로 관찰되는 fibronectin과 청색의 형광신호로 출현하는 tenascin이 많은 난구-관상세포(cumulus-corona cell)들에서 관찰되었으며 특히 fibronectin은 난자에 인접한 관상세포(corona cell)들의 세포질내와 세포막뿐만 아니라 세포외 기질에서 강한 염색반응이 관찰되었다. 그리고 fibronectin과 tenascin의 발현부위는 서로 일치하는 경향을 보였다. 녹색의 형광신호로 나타나는 laminin은 난구세포의 세포막을 따라서 그리고 세포외 기질에서 출현하였으며 fibronectin이나 tenascin과의 발현부위가 대부분에서 일치하였지만 드물게는 발현부위의 차이를 보이기도 하였다. 전자현미경 검색결과 난구세포의 성장 및 확장은 배양시간의 경과에 따라 증가하였다. 난자에서 멀어질수록 난구세포의 크기가 커지고 세포의 밀집도가 증가하였으며 세포사이의 공간이 적어져 세포들 사이에 접촉면이 많아졌다. 세포사이의 공간내로 돌출되는 가늘고 긴 미세융모(microvilli)가 다수 관찰되었으며 세포들 사이에 접촉면을 따라 길고 짧은 선모양의 간극결합(gap junction)을 흔히 볼 수 있었다. 특히 난구세포체 주변에 위치한 세포들의 세포질내에는 스테로이드 호르몬의 생성과 관계가 깊은 미세구조물들, 즉 관상의 사립체, 잘 발달된 활면 내형질망, 전자치밀성 지방적(fat droplet)과 이들과 연관된 세사다발(microfilaments)와 세관구조물(microtubules) 등이 보다 풍부히 관찰되었다. 그러나 단절된 기저막의 흔적 이외에 세포외 기질과 관계되는 미세구조물들은 관찰하기 어려웠다. 결론: 따라서 난자-난구 복합체내에서 이러한 부착단백들의 발현양상과 분포의 차이뿐만 아니라 전자현미경적으로 관찰되는 스테로이드 호르몬생성과 관계가 있는 미세구조물들의 형태학적 변화를 고려하여 볼 때 난자-난구 복합체를 구성하는 주변부 난구세포와 중심부 관상세포의 기능이 서로 다를 것으로 생각되었다.

Objective: Immunofluorescence microscopy including confocal laser scanning microscopy and electron microscopy were used to study the production of fibronectin, tenascin, and laminin in the cumulus-corona (CC) cells surrounding mature, unfertilized oocytes after ovulation in view of their presumptive importance in the coordination of the processes leading to fertilization and early embryo cleavage, including the final maturation of the ovum, the sperm-egg interaction, and the complex biochemical mechanism between the ovum and the oviduct. Methods: Mature oocyte-cumulus complex (OCC) was cultured for 24 and 48 hour and fixed in 3.7% formaldehyde. Specimens were incubated with a mixture of primary monoclonal antibodies recognizing different epitopes of fibronectin, tenascin, and laminin, and then with a mixture of secondary antibodies containing FITC, TRITC, and Cy-5 conjugated antibodies. Observation was made by confocal laser scanning microscope equipped with epifluorescece optics. Transmission electron microscopy were used to observe the OCC at 24 and 48 hours after cultrue. Results: The immunocytochemical date demonstrated that CC masses are capable of producing fibronectin and tenascin but their production is heterogeneous in the CC population. Immunoreactivity to fibronectin and tenascin was shown mostly by inner corona cells, and the intensity of immunofluorescence decreased from the central corona cells to the peripheral cumulus cells. Colocalization of fibronectin and tenascin was evident in most CC cells. Moreover, fibronectin and tenascin immunoreactive material was observed in the intracytoplasmic areas, at the plasma membrane level as well as in the extracellular matrix. Whereas, laminin immunofluorescence was found around plasma membrane and extracellular area, but a intracytoplasmic reaction was rarely observed. The distribution of laminin immunofluorescence was similar to that of fibronectin and tenascin, but in some cumulus cells, colocalization between them was not found. Ultrastructurally, cumulus cells projected numerous long, thin microvilli into the intercellular area and some micovilli penetrated into zona pellucida. The inner layer of the cumulus mass was loose arrangement of relatively uniform, small cells with widened intercellular spaces, whereas in the outer layer, cumulus cells are rather larger in size and compact arrangement by narrow, irregular spaces. A small and large linear gap junctions were easily found at cell contacts. The cytoplasm of most cells had abundant organelles typical of steroidogenesis: numerous mitochondrias, a well-developed smooth endoplasmic reticulum, electron dense lipid droplets, and bundles of microtubules and microfilaments. Rudimentary disrupted basal lamina along the cytoplasmic border was rarely seen in a few inner conora cells. Conclusion: Even though the functional role of these extracellular matrix proteins remains still unclear, it is reasonable to suggest that they are necessary in various steps of the reproductive process. Cumulus cells appears to be a heterogeneous and dynamic system for suitable microenviroment of fertilization. And functional differences between corona and cumulus cells during the oocyte denudation may be accounted for particular distribution of these adhesive proteins and steroidogenesis-related organelles.