유식 세포분석기는 DNA 함량의 측정과 세포 표면에 존재하는 세포 표지물들의 발현에의한 세포 분화의 정도를 측정할 수 있는 유용한 도구로서 알려져 있다. 최근에는 세포 표면항원 뿐만 아니라 세포내에 존재하는 여러 종류의 항원 특히 종양단백과 DNA 함량을 동시에 측정함으로서, 세포의 성장과 분화에 따라 일어나는 변화에 대하여 다원적인 분석이 가능한 유식 세포분석기를 이용해 보려는 시도들이 이루어지고 있다. 그러나 세포내 항원의 측정에는 세포 고정후에 항체의 세포내 투과가 어려워 임상적 이용에는 한계를 가지고 있다. 본 연구에서는 HL-60(promyelocytic leukemic) cell line에서 1% paraformaldehyde와 세포막의 투과제로 알려져있는 lysolecithin의 혼합용액을 이용하여 세포를 고정하고 세포내로 단클론항체를 투입시켜 세포내의 종양 항원을 효과적으로 염색할 수 있는지 알아보고 이로서 세포 표면 항원, 세포내 종양 항원 및 DNA 함량의 동시 측정이 가능한지를 알아 보고자 본 연구를 시도하였다. HL-60 cell line에서 먼저 PE와 결합된 My-7 monoclonal antibody를 이용하여 세포 표면의 My-7 항원에 대한 염색을 한다음, 1% paraformaldehyde solution과 20 ㎍/ml lysolecithin의 혼합 용액으로 세포막의 고정과 세포내로 투과가 가능한 상태로 만든 후 anti-human anti c-myc mouse IgG monoclonal antibody와 fluorescein isothiocyanate(FITC)와 결합된 anti-mouse goat IgG[F(ab`) 2] antibody를 차례로 반응시켜 세포내의 c-myc 종양 항원을 염색하고, 다시 7-amino-actinomycin D(7-AAD)로 DNA를 염색하였다. 이와 같은 염색과정은 세포내의 종양 항원의 염색이 가능함은 물론 세포막 항원의 보존이 가능하고, 7-AAD에 의해 염색된 DNA의 G0G1 분기 정점의 변이 계수(coefficients of variation; CV)도 비교적 낮았다. 따라서 저자들에 의한 세포표면 항원, 세포내 종양 항원 및 DNA에 대한 연속적인 동시 염색방법은 악성 종양에서 세포 분화의 정도를 포함하여 종양단백의 발현 정도와 세포 주기의 변화들에 대한 다원적 분석을 가능하게 하여, 종양세포들에 대한 생물학적 특성들을 분석하고 종양의 진단 및 치료의 판정이나 예후의 측정에 유용할 것으로 생각된다.

Flow cytometry, a useful tool for measuring DNA content and cell differentiation as expressed by cell surface markers, is utilized to measure multiple antigens, especially surface antigen, intracellular oncoprotein, and DNA content, simultaneously. For this simultaneous detection, several methods off ixation and permeabilization have been used with limited values. In this study, 20 ㎍/ml of lysolecithin in 1% paraformaldehyde solution was utilized for fixation and permeabilization of cultured promyelocytic leukemic cells(HL 60). The cells were first stained with phycoerythrin (PE)-conjugated monoclonal antibody to the cell surface My 7 antigen and then were fixed and permeabilized with 20 ㎍/ml of lysolecithin in 1% partormaldehyde solution. After incubation, the fixed and permeabilized cells were stained with monoclonal antibody to intracellular c-myc antigen, which were followed by fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated secondary antibody. The c-myc stained cells were finally stained for DNA content with 7-amino- actinomycin D(7-AAD). This procedure permits excellent staining for intracellular oncoproteins and preservation of surface antigens with relatively low cofficients of variation (CV) for the G0G1 peak of the DNA histograms and suggests that the sequential staining procedure of surface antigen, intracellular antigen, and DNA content will be extended for the study of correlations with cellular differentiation, expression of oncoproteins, and cell cycle analysis in the cells which are obtained from human malignant diseases using a 488 nm single laser flow cytometry.